Comment préparer une goutte suspendue

Pour déterminer la structure 3D d'une protéine , vous devez d'abord un cristal pur de lui . La méthode à goutte utilise une goutte de solution contenant des protéines pendaison d'une lamelle. Sous cette goutte suspendue se trouve un réservoir avec une concentration en sel plus élevée que celle de la goutte. Au fil du temps , de la vapeur d' eau quitte la baisse et finit dans le réservoir , ce qui provoque la cristallisation de la protéine . Chaque protéine nécessite des conditions différentes ( tels que la concentration de sel et pH ) , et souvent essai et erreur propose la seule façon de trouver les bons conditions.Things Vous aurez besoin manteau
de laboratoire , des gants et des lunettes de protection
Micropipette avec pipette conseils
1 solution molaire de chlorure de sodium à 0,05 tampon acétate molaire , pH 4,7
2 tubes Eppendorf ml (ou similaire )
24 puits graisse plaque
à vide de centrifugeuse en seringue
siliconés lamelle
air comprimé
pincettes
Clay (par exemple, la pâte à modeler ou similaire )
50 mg /ml de lysozyme dans 0,05 solution tampon d'acétate molaire , pH 4,7
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Photos 1

Mettre sur les engins de laboratoire ( manteau , des gants et des lunettes de protection ) .
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Utiliser une micropipette à ajouter 1,1 ml de chlorure de sodium (sel ) et une solution de tampon acétate en un tube Eppendorf .
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Centrifuger le tube Eppendorf fermé avec la solution de sel à l'intérieur pendant environ cinq minutes à 13000 rpm . Rappelez-vous la centrifugeuse pour équilibrer en plaçant un autre tube Eppendorf contenant 1,1 ml d'eau en face de et à l'opposé du tube de solution de sel .
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Ajouter 1 ml de la solution de sel d' un puits dans un 24 puits plaque .
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Utiliser une seringue remplie de graisse de placer une fine couche de graisse autour de la jante de ce bien . Veillez à ne pas ajouter trop ou trop peu . Si vous ajoutez trop de graisse, la graisse couler dans le bien et peut-être ruiner votre expérience . Si vous utilisez trop peu , le bien ne sera pas étanche à l'air et votre expérience ne fonctionnera pas . Visez juste assez de graisse que la lamelle et la graisse forment un joint étanche à l'air plus tard .
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Rouler la pâte avec vos mains pour faire quatre petites boules , et les pousser sur les quatre coins de la 24 bien plaque . Ils agiront en tant que supports pour assurer la couverture de la plaque n'entre pas en contact avec la lamelle.
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Utiliser l'air comprimé pour souffler toute poussière hors de la lamelle. Tenez la lamelle avec une paire de pinces propres .
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Aspirer 4 microlitres de la solution de lysozyme avec votre micropipette , et ajouter cette solution au centre de la lamelle. Changer les embouts de pipette , et ajouter 4 microlitres de la solution de sel . Pipette doucement de haut en bas , sucer dans le liquide puis l'expulser , pour mélanger la solution de sel de la solution de lysozyme . Prenez soin de mélanger les deux sans disperser le liquide partout dans la lamelle.
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Tourner la lamelle sur rapidement pour le fluide ne glisse pas , et plante carrément au-dessus du puits. Prenez soin d'appuyer doucement sur ​​lui afin qu'il forme un joint étanche à l'air avec la graisse sur tout le pourtour du puits.
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Poussez le couvercle de la plaque à 24 puits sur les billes d'argile , et de laisser la plaque dans un endroit frais .