Le clonage TOPO protocoles

clonage TOPO est un procédé de clonage qui utilise , en général , «A 3 résidus qui sont thermodynamiquement instables et les combine avec une ADN polymérase Taq . En outre , le procédé utilise un produit de réaction en chaîne par polymerase fraîche (PCR) qui doit être stocké à 4 degrés Celsius. Cette forme de clonage optimise la topoisomérase I actif molécule ajouté à la fin d'un vecteur linéaire . Pour effectuer le clonage TOPO , un certain protocole doit être suivi . Préparation

Certaines étapes de base peuvent être prises pour accélérer l'ensemble du processus de clonage TOPO et en assurer le succès . Tout d'abord, les tubes de cellules viables doivent être placés sur la glace pour maintenir leur acceptabilité . Ensuite, le milieu de culture des super optimal ( SOC) , la croissance bactérienne enrichie en nutriments , doit être portée à la température ambiante. Les plaques sélectives devraient ensuite être pré- chauffé à 37 degrés Celsius de sorte qu'ils sont tout à fait prêts lorsque vient le temps de les utiliser .
Combinant des ingrédients

Pour commencer le clonage processus , une combinaison de deux microlitres de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , produit 0,5 microlitres de solution de sel , et 0,5 pi de vecteur de clonage doit être combiné dans un tube à centrifuger de 0,5 ml. Une fois combinés, ces ingrédients doivent être mis à la température ambiante et on laisse incuber pendant cinq à dix minutes. Ensuite, les ingrédients combinés seront ajoutés au "Top - 10 des cellules chimiquement compétentes " dans un tube de 50 microlitres et placés sur la glace pendant dix minutes supplémentaires . Après cela, les cellules doivent être un choc thermique à 42 degrés Celsius exactement et placés sur de la glace pendant une minute supplémentaire avant 180 microlitres du milieu SOC est ajouté . Ce mélange doit alors être agité dans une direction horizontale à 200 tours par minute pendant une heure supplémentaire à 37 degrés Celsius .
Étapes finales

Un mélange de 50 microlitres et 100 microlitres de chaque réaction doivent être étalées " sur LB + AMP plaques + X -Gal et incuber sans agitation pendant une nuit à 37 ° C " Le lendemain, les trois colonies blanches de chaque réaction doit être enlevé et placé dans 4 ml de LB + AMP et laissée à incuber pendant une nuit à une température de 37 ° C tout en étant agité à 200 tours par minute. La dernière étape est la mini- préparation des plasmides et attendent de voir si le processus a été un succès .