Comment calibrer les colonnes de filtration sur gel

colonnes de filtration sur gel sont utilisés pour séparer les protéines à partir de mélanges complexes . Etant donné que chaque protéine a un poids moléculaire unique, elles peuvent être induites à se séparer en couches distinctes par leur migration à travers une colonne de filtration contenant une matrice de gel uniformément répartie. Pour identifier correctement chaque protéine qui est séparé , vous devrez calibrer les colonnes à l'aide de plusieurs protéines de weight.Things moléculaires connus que vous devez sel basale de
anhydrase carbonique
cytochrome C
aprotinine
tubes à centrifuger
Pompe de Centrifugeuse
Pipet de ferritine
250 ml graduée
liquide tampon
nettoyage scientifique lingettes
seringue baril
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Photos 1

Retirer les flacons de l'anhydrase carbonique , cytochrome C et de l'aprotinine du réfrigérateur ou du congélateur et laissez-les à température ambiante . Ajouter 4 mg de chaque protéine à un tube de centrifugation par millilitre de gel dans la colonne de filtration . Ajouter 961 mcl de sel basai par milligramme de protéine dans chaque tube de centrifugeuse pour dissoudre les protéines . Ajouter 39,2 mcl de ferritine par millilitre de gel à chaque tube et mélanger ensuite dans une centrifugeuse .
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Désactiver la pompe de la colonne de filtration et fermer le robinet d'arrêt à l'entrée de la colonne. Dévissez , mais ne retirez pas , le haut de la colonne de filtration . Régler la pompe au débit maximal de la colonne et redémarrer la pompe jusqu'à ce que le matériau tampon a été soutiré . Arrêter la pompe .
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Ajouter 1 ml de chaque protéine de la colonne de filtration à l'aide d'une pompe à pipette . Goutte à goutte les protéines vers le bas à l'intérieur de la colonne d'une hauteur de 1 cm à 2 cm , de travail autour du bord intérieur de la colonne. Laisser le mélange de protéines de s'installer au-dessus de la matrice de gel .
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Placez le tuyau de sortie de la pompe dans un endroit propre , sec 250 ml graduée . Redémarrer la pompe à un débit de 0,30 ml par minute et exécuter les protéines dans la matrice de gel . Alors que la pompe est en marche , rincer les parois du tube à l'aide de la pompe de la pipette et une petite quantité de liquide tampon . Une fois les protéines ont pleinement saisi la matrice de gel , de réduire la vitesse de la pompe à 0,02 ml par minute et la pompe à 5 cm à 7 cm couche de liquide tampon sur le dessus de la matrice .
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Débranchez le colonne bouchon du robinet . Nettoyer le chapeau de colonne et l'intérieur de la colonne en utilisant des lingettes de nettoyage scientifiques. Remettre le bouchon de colonne . Remplir le réservoir tampon de liquide tampon. Attacher un corps de seringue sur le robinet et ouvrir. Utiliser la seringue pour aspirer une petite quantité de solution tampon à travers le tube et dans la seringue. Fermer le robinet et la rattacher à la tête de la colonne . Ouvrir le robinet et vérifier les fuites .
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Exécutez la colonne à 0,02 ml par minute pendant plusieurs jours , jusqu'à ce que la bande de ferritine approche de la fin de la colonne . Recueillir tout le gel de filtration qui est pompé dans le cylindre gradué .