Comment mettre en place une expérience individuelle Patch -Clamp

L'expérience de patch-clamp est utilisé pour mesurer des cellules vivantes simples . Il le fait avec une très fine pipette tenue étroitement contre la membrane de la cellule unique (le revêtement extérieur de protection ) . L'ouverture de cette pipette est seulement d'environ 1 micron (un millième de millimètre) et est commandé avec un microscope optique . Les cellules sont maintenues dans un plat uniforme en utilisant un détacheur de la cellule, telle que la trypsine . Une cellule spécifique est choisie et l'embout de pipette est placé sur la membrane cellulaire . Un joint d'étanchéité est formé par aspiration et une partie de la membrane est aspiré dans les pipette.Things Vous devez
plaque cellulaire
tampon phosphate salin , ou PBS ( sans calcium et magnésium ) Photos trypsine Photos incubateur
10 millilitres pipette
HEK ( keratinocyctes épidermiques humaine ) moyen
sérum de veau foetal (FCS )
solution d'enregistrement externe Centrifugeuse de puce
patch clamp
Twist cap
Electrode
Voir Instructions
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obtenir une plaque pour les cellules . Laver la plaque deux fois avec 10 ml de PBS ( tampon phosphate salin ) sans calcium et magnésium . Ajouter 2 ml de détacheur ( trypsine ) . Incuber la plaque pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Observer la plaque sous le microscope pour s'assurer que les cellules ont détaché. Déplacer doucement la plaque pour détacher toutes les cellules du fond de la plaque . Ajouter 10 ml de HEK ( Les keratinocyctes épidermiques humains ) et FCS ( sérum de fœtus de vache ) moyen . Utiliser une pipette de 10 ml pour déplacer les cellules de haut en bas .
2

Respecter les cellules sous le microscope afin de s'assurer qu'ils sont des cellules individuelles. Pipette utilise la pipette 10 ml jusqu'à ce que les cellules sont individuelles, si nécessaire . Centrifuger les cellules pendant deux minutes à 1000 tours par minute . Jeter le surnageant . Placer les cellules dans 10 ml de sérum de veau foetal . Centrifuger les cellules à nouveau pendant deux minutes à 1000 tours par minute . Jeter le surnageant . Placer les cellules dans 200 ul de solution d'enregistrement externe. Respecter les cellules sous le microscope des cellules individuelles avec une membrane lisse .
3

Placer la solution saline à l'intérieur d'une puce patch-clamp . Ajouter une goutte de solution d'électrolyte intracellulaire à la partie inférieure de la puce à l'aide d'une pipette . Montez la puce sur un bouchon dévissable . Le bouchon à vis doit contenir l'électrode de référence et la ligne d'aspiration . Ajouter une goutte de solution d'électrolyte extracellulaire à la partie supérieure de la puce à l'aide d'une pipette . La solution d'électrolyte permet la puce pour établir un contact avec l'électrode. Ajouter 5 pi de suspension cellulaire à la solution saline dans la puce. Placez une seule cellule en utilisant une aspiration à travers une pipette . Aspiration peut être effectuée manuellement par l'aspiration d'air à travers la pipette . Le positionnement de la résistance augmente de cellules pour former un joint . Le joint permet d'enquête de la cellule entière.