Comment utiliser les niveaux de glutathion dans Détection ROS

glutathion , ou GSH , est un tripeptide non essentiel fabriqués à partir de la cystéine , le glutamate et la glycine . Il est un antioxydant puissant qui protège les cellules et les organes du corps contre les effets nocifs de ROS ou des espèces réactives de l'oxygène , qui sont formés à partir de l'oxygène moléculaire à la suite de divers processus métaboliques dans le corps . Des antioxydants, tels que le glutathion , neutralisent la ROS et les empêcher d'interagir avec et d'endommager l' ADN et des protéines dans les cellules . Le rapport de forme oxydée et réduite de GSH dans votre corps est indicatif de stress oxydatif ROS liées à vos body.Things Vous devez
l' aiguille de papillon de seringue
l' héparine de sodium de Centrifugeuse
Congélateur
acide Sulfosalicylic
source lumineuse microplaques Photos de l'agent de réaction GSH
solution standard GSH
Voir Instructions
1

Dessine environ 2 ml de sang par ponction veineuse dans la veine anticubetal avec une aiguille à ailettes de calibre 23 fixée à une seringue de 5 ml . Ajouter l'échantillon à tester des tubes contenant de l'héparine de sodium et doucement inverser le tube pour mélanger .
2

Recueillir les globules rouges par centrifugation de l'échantillon à 2500 tours par minute pendant cinq minutes . Congeler et décongeler l'échantillon trois fois pour briser les cellules . Centrifuger la solution de lysat cellulaire pendant 10 minutes à 12 000 rpm et 4 degrés , et recueillir le surnageant .
3

Retirer la protéine de l'échantillon par addition d'acide sulfosalicylique de 5 pour cent et centrifugation de l'échantillon à 12 000 tours par minute pendant cinq minutes à 4 degrés . Stocker le surnageant déprotéinées à -112 degrés .
4

Mélanger un agent de détection de thiol , GSH réductase , la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate et le tampon de dosage dans des proportions indiquées par le fabricant du kit pour faire le mélange réactionnel GSH . La quantité de chaque produit chimique dépend du nombre de tests que vous souhaitez effectuer . Diluer le mélange réactionnel GSH dans de l'acide sulfosalicylique de 5 pour cent pour obtenir des concentrations de 16 , 32 , 63 , 125 , 250 et 500 microlitres .
5

Ajouter 1 à 10 microlitres de l'échantillon de sang déprotéinées dans les puits d'une microplaque . Ajouter la solution standard GSH dilué en série , qui est disponible dans le kit d'essai , à chaque puits pour amener le volume total de chaque puits à 10 microlitres .
6

Ajouter 90 microlitres de mélange réactionnel GSH que vous faites dans l'étape 4 pour chaque puits de la microplaque. Mélanger le réactif en secouant la plaque pendant 30 secondes .
7

Mesurer immédiatement l'absorbance en plaçant la plaque à la lumière de longueur d'onde de 405 et 415 nanomètres . Incuber la plaque pendant 30 minutes. Prenez les lectures d'absorbance après toutes les cinq minutes pendant l'incubation .
8

Diluer 6 mM de l'échantillon traité avec de l'acide sulfosalicylique de 5 pour cent et solution trifluromethane sulfonate. Cela permettra d'éliminer toute la GSH réduit de la solution . Ajouter 1 et 10 micoliters de cette solution dans les puits de microplaques et répétez les étapes 5 , 6 et 7 . Cela vous aidera à estimer la quantité de GSH oxydé dans l'échantillon .
9

Tracer l'absorbance et l'échantillon concentrations sur un graphique pour obtenir la courbe à la fois pour le glutathion GSH réduit et oxydé . Calculer le rapport entre les deux formes de GSH . Des niveaux accrus oxydatif niveaux de glutathion indiquent le stress oxydatif et ROS .